中华石蝴蝶组织培养及试管开花诱导

　　中华石蝴蝶（Petrocosmea sinensis Oliv.）为苦苣苔科石蝴蝶属多年生草本植物，产于云南北部、四川和湖北西部，生于低山阴处的石上。目前，苦苣苔科（Gesneriaceae）植物在全世界约有140属2 000余种，中国有58属（其中28属特产中国）463种，从辽宁到海南均有分布，多数属、种分布于云南、广西、广东等省（区）热带及亚热带石灰岩的陡崖上[1]。苦苣苔植物很多品种花色艳丽，观赏价值。此外，芒毛苣苔属、非洲紫苣苔属、大岩桐属，中国产的吊石苣苔、蚂蟥七、牛耳朵等具有药用价值[2]。由于许多苦苣苔科植物分布区域狭窄，对生长条件要求苛刻，加上民间的过度采挖，使许多苦苣苔科植物的野生资源濒临绝种[3]。

　　中华石蝴蝶不仅花色美丽，可作为观赏花卉，同时也是一种中药材，以全草入药，具有清热解表、健脾和胃等功效，可用于治疗感冒、小儿疳积等症状[4]。本研究通过对中华石蝴蝶组织培养的技术研究，探索行之有效的中华石蝴蝶繁殖技术并通过仿生栽培，可以对其野生资源进行有效保护。试管开花是利用组织培养技术使组培植物在离体环境下开花的一种现象，不受季节的限制，可以通过控制相应的条件，让组培植物进入开花时期[5]。中华石蝴蝶的试管开花可为人们对鲜花日益增长的需求提供广阔的市场。因此，利用植物组织培养技术对中华石蝴蝶进行培养并对其试管开花作初步探究，研究其开花机制，具有重要的现实意义和应用价值。本研究在中华石蝴蝶组织培养的基础上，进行无菌苗的试管开花诱导，可为研究其花期生理和调控提供基础资料。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　中华石蝴蝶采取广西壮族自治区药用植物园科研基地内健壮无病害的植株，选取其幼嫩的叶片为外植体。

　　1.2外植体消毒

　　将采回的外植体在流水下缓慢冲洗，并用软毛刷轻轻擦拭去除表面的污垢，放入烧杯中，用适量浓度洗洁精溶液浸泡15 min后，再用流水冲洗10 min。将材料移至超净工作台上，用75%乙醇表面消毒15 s后用无菌水冲洗2次，再用0.1%氯化汞溶液浸泡8 min，用无菌水浸泡冲洗5次，将氯化汞溶液彻底洗出。在无菌器皿中将外植体与消毒液接触的伤口切除，接种于诱导培养基中，以诱导出的丛生芽作为试验材料。

　　1.3继代增殖

　　取无菌中华石蝴蝶丛生芽，接入添加不同浓度植物生长调节剂6-BA、NAA、IAA的MS+30 g/L蔗糖+4.0 g/L琼脂的培养基中，调节培养基的pH值为5.8，设置其培养条件为平均光照度1 500～2 200 lx，光照时间12 d/h，培养温度（25±3） ℃，考察不同培养配方对中华石蝴蝶继代的影响。

　　1.4生根培养

　　挑取继代培养得到的增殖苗，单切丛生芽为单芽，接入添加不同浓度的植物生长调节剂6-BA、NAA的MS+蔗糖 30 g/L+琼脂4.0 g/L培养基中，另一部分接入添加1 mg/L活性炭的上述培养基中生根，设置其平均培养条件为光照度1 500～2 200 lx，光照时间12 d/h，培养温度（25±3） ℃，考察不同培养基配方对中华石蝴蝶生根率的影响。

　　1.5植物生长调节剂对中华石蝴蝶诱导开花的影响

　　选取继代增殖的无菌苗，接种到MS培养基以及添加6-BA、NAA的MS培养基上，每种培养基中含有30 g/L蔗糖、4.0 g/L 琼脂，培养条件为平均光照度1 500～2 200 lx，光照时间12 d/h，培养温度（25±3） ℃，在培养期间观察植物的生长情况并记录试验结果。

　　1.6继代培养对中华石蝴蝶试管开花的影响

　　设计1组继代试验，中华石蝴蝶试管苗每40 d转接至继代培养基中继代培养1次，比较连续继代、只继代1次对中华石蝴蝶试管开花的影响。

　　2结果与分析

　　2.1继代增殖

　　切取诱导出的芽，将其接种在不同外源激素配比的继代增殖培养基中，每天观察接入芽发生的微小变化，大概10 d后开始有新芽出现，一段时间后芽苗的数量慢慢增多，于60 d后统计芽的增殖系数。表1表明，MS+1.0 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA+0.1 mg/L IAA培养基中华石蝴蝶的长势好，增殖倍数高，芽粗壮，叶色翠绿，部分出现幼根但比较弱。从试验结果可以看出，中华石蝴蝶的增殖率会受到6-BA含量的影响，在0～1.0 mg/L范围内，在低含量时芽的生长速度相对较慢；随着6-BA含量的增大，芽的增殖倍数不断增大，有效芽苗的数量也不断增加；但当6-BA含量大于 1.0 mg/L，达到1.5 mg/L时，芽苗相对长势比较弱，部分出现玻璃化现象，有效的芽苗数量减少，表明6-BA含量过高反而抑制了中华石蝴蝶的生长。较好的芽苗生长情况见图1。

　　2.2生根培养

　　将继代培养得到的增殖苗单切丛生芽为单芽接入不同植物生长调节剂含量的生根培养基中，一部分接入添加 1.0 mg/L 活性炭的上述培养基中。表2结果表明，中华石蝴蝶在上述培养基中均能生根，但在MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭培养基上生根效果好，植株长势较好，平均的生根数为18条/株，平均根长3.62 cm，生根率，生根苗相对粗壮，利于试管苗的移栽。其中IBA影响苗的生长，当培养基中只添加IBA时生根数较少，根较细、弱，质量不好。NAA、活性炭对生根有促进作用，两者同时配合使用时，生根效果好（图2），但NAA含量过高，对生根也会产生抑制作用。

　　2.3不同植物生长调节剂对中华石蝴蝶试管开花的影响

　　以MS培养基为空白对照，剪取长势良好的中华石蝴蝶无菌试管苗，接种于研究试管开花的培养基中，比较在基本培养[CM（25]基中添加6-BA、NAA激素对中华石蝴蝶试管开花的影响。表3表明，中华石蝴蝶在不添加任何激素的MS培养基中能够正常生长，但不能进行试管内开花，培养一段时间后，试管苗会出现黄化的现象；在MS培养基中分别添加激素6-BA、NAA，试管内开花率明显高于对照培养基MS，在只添加激素6-BA的基本培养基中，花序比较纤细、幼弱，而当同时添加2种激素时，中华石蝴蝶试管开花率高，花开得更大、更伸展，花色相对艳丽（图3）。结果说明，6-BA、NAA激素配合使用，对中华石蝴蝶的试管开花有促进作用。

　　2.4继代培养对中华石蝴蝶试管开花的影响

　　设计1组试验，比较不同继代培养次数对中华石蝴蝶试管开花的影响。分别剪取中华石蝴蝶持续继代、只继代1次的无菌试管苗，接种在利于试管开花的MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培养基中，连续培养3个月，观察并记录试验结果。结果显示，减少继代培养的次数利于试管开花，继代1次的中华石蝴蝶的开花率明显高于持续继代的，表明持续继代会抑制中华石蝴蝶的试管开花。

　　3讨论与结论

　　在组织培养的过程中，培养基中不同生长调节剂的配比是诱导植物产生芽、根的关键因素[6]。不同的植物在组织培养中所需要激素的种类和含量是不同的，同大多数苦苣苔科植物一样，培养基中细胞分裂素、生长素的含量和配比对中华石蝴蝶组织培养中芽的增殖和生根起着决定性的作用。6-BA 是目前使用广泛的细胞分裂素，其含量在合适的范围内才有利于植物的生长，过高会抑制植物生长而出现玻璃化，过低则不利于芽苗增殖。IAA是促进细胞分裂和生长的内源性激素，在中华石蝴蝶的组织培养过程中，添加6-BA的同时配合NAA、IAA使用，并使其达到合适的比例，才能达到较为理想的效果。在本试验中，中华石蝴蝶的继代增殖在MS+10 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L IAA培养基中较好，增殖倍数高，芽苗粗壮且颜色翠绿。在培养基中添加活性炭可有效防止褐变，提供生根的暗环境，降低培养基中的盐离子浓度或吸附利于生根的物质[7]。中华石蝴蝶在添加活性炭的MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭培养基中生根率达到。

　　中华石蝴蝶在MS培养基中可以生长但不能进行试管开花，说明激素是中华石蝴蝶开花所需要的条件，在培养基中加入6-BA可以促进开花，因为植物在开花分化时，细胞分裂素是必不可少的[8]。当培养基中只添加单一的激素时，诱导试管开花率相对都比较低，在试验中发现，6-BA配合使用一定量的生长激素NAA时能使试管开花率提高。这也进一步说明细胞分裂素与生长素的组合使用可产生更利于中华石蝴蝶试管开花的交互作用效果。本试验成功诱导了中华石蝴蝶试管开花，但开花率仍需要进一步提高，关于其开花的调控机制尚须深入研究。

　　来源：江苏农业科