植物组织培养步骤

　　植物组织培养快繁技术是生物技术领域中的一项新技术，也是高科技技术。以前大多停留在实验室阶段，如今部分企业已经实行产业化市场运作，直接服务于经济发展。植物组织培养生产是一个系统工程，从一个外植体(芽、侧芽、叶片、茎段、花梗、花托、根段、根芽等)→启动培养产生中间繁殖体→中间繁殖培养→生根幼苗培养→试管苗驯化移栽→田间定植，这些环节都需要熟练的操作技术，才能保证生产计划的按时完成。操作技术主要包括熟练地配制培养基，具备娴熟的接种技术，掌握各种灭菌技术，以大限度地减少污染的发生。操作人员应具备一定的化学知识，以对实验室基本设备进行日常管理及维护。

　　一、培养材料的采集

　　组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中根尖不易灭菌，一般很少采用。

　　对于木本花卉来说，阔叶树可在一、二年生的枝条上采集，针叶树种多采种子内的子叶或胚轴，草本植物多采集茎尖。

　　在快速繁殖中，常用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1毫米以下。

　　二、培养材料的消毒

　　（一）先将材料用流水冲洗干净，后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。

　　（二）在无菌坏境中将材料放入70％洒精中浸泡30－60秒。

　　（三）再将材料移入漂白粉的饱和液或0.01％升汞水中消毒10分钟。

　　（四）取出后用无菌水冲洗三、四次。

　　三、制备外植体

　　将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。然后切成0.2－0.5厘米厚的小片，这就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。

　　四、接种和培养

　　（一）接种

　　在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种4－10个。

　　（二）封口

　　接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。

　　（三）温度

　　培养基大多应保持在25℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。

　　（四）增殖

　　外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。

　　（五）根的诱导

　　继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得键壮根系。

　　五、组培苗的练苗移栽

　　试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对湿度98％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。

　　容量瓶配制精确物质的定容技巧。定容主要是用来配制标准溶液或稀释溶液的过程，是特指配制一定物质量浓度时的其中一步，具体可分为计算、称量、溶解、冷却、转移、定容、摇匀、贴签等几步。①检漏：检漏时，检查橡皮筋是否完好，加水至瓶口标准线附近盖好瓶塞，将瓶倒立30 s，观察瓶塞周围是否漏水，然后将瓶直立，把瓶塞转动180°后再盖紧，倒立，触摸瓶颈，仍不渗水，即可使用。②润洗：用蒸馏水润洗3～4次后再用待装溶液润洗，以保证定容后溶液的浓度不发生变化。③定容：引流时玻璃棒伸到刻度线以下;热溶液应凉至室温后对其进行稀释，因为温度升高会使瓶体膨胀，致使所量体积不准确;用少量蒸馏水冲洗玻璃棒、烧杯3～4次，洗出液全部转入容量瓶中，然后用蒸馏水稀释，接近容量瓶标线1～2 cm时用胶头滴管进行滴定以防定容失败;视线与溶液弯月面低点恰好相切;容量瓶用完应及时洗涤干净，塞上瓶塞，并在塞子与瓶口之间夹一条纸条，防止瓶塞与瓶口粘连。