植物组织培养操作技术

　　植物组培快繁技术是生物技术领域中的一项新技术，也是高科技技术。以前大多停留在实验室阶段，如今部分企业已经实行产业化市场运作，直接服务于经济发展。植物组织培养生产是一个系统工程，从一个外植体（芽、侧芽、叶片、茎段、花梗、花托、根段、根芽等）→启动培养产生中间繁殖体→中间繁殖培养→生根幼苗培养→试管苗驯化移栽→田间定植，这些环节都需要熟练的操作技术，才能保证生产计划的按时完成。操作技术主要包括熟练地配制培养基，具备娴熟的接种技术，掌握各种灭菌技术，以最大限度地减少污染的发生。操作人员应具备一定的化学知识，以对实验室基本设备进行日常管理及维护。

　　1 溶液配制技术

　　组培工作中需要配制一定浓度的培养基母液、灭菌剂，这也是组培工作的首要环节，一定要会使用相关的设备仪器，还要懂得各种化学药品性质，才能掌握各种药品溶液的配制技术。

　　1.1 准备工作

　　在配制药品前，要准备相应范围的电子天平，仔细核对各种药品，检查与润洗各种玻璃仪器和器皿。

　　1.2 操作要点

　　1.2.1 电子天平的正确使用及称量。称量前清洁、检查天平水平、调整零点；称量的最大量不得超过天平的最大负荷；具有腐蚀性的化学药品不得直接放入称盘内；称量值超过所需值时用纸筒慢慢摄取，然后关住天平侧门使其读数稳定，直至观察值达到所需值为准；打开或关闭天平门时动作要轻、慢、稳，以防影响最终读数；读数时必须关好天平门，防止气流影响；称量完毕后归零断开电源。

　　1.2.2 溶液混合与溶解。溶液混合时按其化学性质进行溶解，以防止沉淀的产生；溶解时要缓缓加入蒸馏水，不断用玻璃棒搅拌，注意玻璃棒不要碰到烧杯壁，分多次少量洗涤玻璃棒和烧杯并移入容量瓶中，如果是一定浓度的溶液注意刻度线的标线；对需助溶的物质（激素）加入不同助溶剂，微热使其充分溶解。

　　1.2.3 容量瓶配制精确物质的定容技巧。定容主要是用来配制标准溶液或稀释溶液的过程，是特指配制一定物质量浓度时的其中一步，具体可分为计算、称量、溶解、冷却、转移、定容、摇匀、贴签等几步。①检漏：检漏时，检查橡皮筋是否完好，加水至瓶口标准线附近盖好瓶塞，将瓶倒立30　s，观察瓶塞周围是否漏水，然后将瓶直立，把瓶塞转动180°后再盖紧，倒立，触摸瓶颈，仍不渗水，即可使用。②润洗：用蒸馏水润洗3～4次后再用待装溶液润洗，以保证定容后溶液的浓度不发生变化。③定容：引流时玻璃棒伸到刻度线以下；热溶液应凉至室温后对其进行稀释，因为温度升高会使瓶体膨胀，致使所量体积不准确；用少量蒸馏水冲洗玻璃棒、烧杯3～4次，洗出液全部转入容量瓶中，然后用蒸馏水稀释，接近容量瓶标线1～2　cm时用胶头滴管进行滴定以防定容失败；视线与溶液弯月面最低点恰好相切；容量瓶用完应及时洗涤干净，塞上瓶塞，并在塞子与瓶口之间夹一条纸条，防止瓶塞与瓶口粘连[1]。

　　1.2.4 移液管移取母液的移液技巧。制作培养基时需用不同规格的移液管移取不同体积的母液。分度移液管应从最上面刻度起始往下放出所需体积，不能用多少体积就取出多少体积；管尖插入母液不要太深或太浅；当液面升高到刻度线以上时，快速移去洗耳球，立即用右手食指按住管口，将移液管提离液面，管尖垂直接触容器内壁，略微放松食指并轻轻转动移液管，直到溶液的弯月面最低点与颈标线恰好相切为宜，待溶液流尽停留15　s；如果移液管上标有“吹”字，则最后残留在管内的液滴必须吹出；使用完移液管，清洗其内外壁，再放回原处；清洗、移液过程中溶液不能滴到桌面、地面。

　　2 培养基制作技术

　　培养基是植物组织培养的“血液”，其成分及供应状况直接关系到外植体的生长与分化。采用更适于植物生长的培养基提供植物材料生长发育需要的养分和生长调节物质。常用的培养基有MS、1/2MS、White，现以MS为例介绍其制作、分装与灭菌的操作技术。

　　2.1 准备工作

　　进行培养基制作前，将所需要的量筒、烧杯、吸管、玻璃棒等仪器放在指定位置。使用前仔细观察母液是否变色或沉淀以及各种母液的名称、浓度、配制日期。称量琼脂、蔗糖，准备好蒸馏水以及培养瓶等。

　　2.2 操作要点

　　取适量的蒸馏水放入容器，微热使琼脂充分溶化呈现半透明状，加入蔗糖待其完全溶解，将移取的各种母液加入容器内，并用玻璃棒搅拌使其混合均匀，定容，调整并测其pH值3～4次，最后进行分装、灭菌。

　　2.2.1 pH值。MS培养基的pH值由灭菌前的5.8降到5.5，造成pH值下降的最主要原因是高温灭菌过程中EDTA铁盐与其他微量元素发生相互作用所致。MS培养基的凝固与pH值呈正相关。当pH值低于5.5时，培养基一般不能很好地凝固，随pH值的提高，培养基的凝固效果明显改善。植物组织在一定pH值下才能正常生长。因此，在配制时考虑培养基凝固情况的同时，也要注意pH值的大小。

　　2.2.2 分装。分装时要掌握好分量，以注入培养容器的1/4～1/3为宜。分装时不要将培养基沾到瓶壁上，分装后立即上盖，做好标记。

　　2.2.3 高压湿热灭菌。培养基采用湿热灭菌法，把分装好的培养基置入高压锅中，排列均匀，瓶间留有一定空隙，关闭锅盖，接通电源。当压力升至0.11　MPa（温度121　℃）时，维持15～30　min，断开电源。当压力降到“0”时，打开排气阀，排掉剩余蒸汽，打开锅盖取出培养基[2]。 　　3 灭菌与清洗技术

　　在组织培养过程中消毒、灭菌是不可忽视的环节。消毒、灭菌将外植体、接种器材、接种室等带有的细菌杀死以减少污染，提高试管苗成活率。

　　3.1 灭菌

　　3.1.1 外植体灭菌。采集的外植体沾有很多污染物，在接种前必须将其放在自来水下冲洗1　h，并将比较大的外植体剪小，进行初步处理以利于在容器中放置和接种过程的操作；将外植体带入无菌操作室，用75%酒精溶液浸泡10～30　s，然后用0.1%升汞溶液浸泡30　min，用无菌水冲洗3～5次，将外植体上的水珠用无菌纸吸干，然后进行接种。

　　3.1.2 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌。接种过程中可将镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%酒精中，使用前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后立即使用。

　　3.1.3 玻璃器皿干热灭菌。干热灭菌是利用烘箱加热到160～180　℃以杀死微生物。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥、包装，以免灭菌后取用时重新污染。烘箱内放置的物品不宜过多，以免妨碍热对流和穿透。

　　3.1.4 室内空间紫外线和熏蒸消毒灭菌。①紫外线灭菌：在无菌操作间、超净工作台用紫外线灭菌。紫外灯距照射物1.2　m以内紫外线杀菌能力最强。②熏蒸消毒灭菌：熏蒸消毒灭菌可采用以下2种熏蒸方法：一是烟雾熏蒸剂。利用杀菌剂的烟雾进行空间消毒。将药物与易燃发烟物搅拌均匀，点燃后发烟但不能有燃烧火焰，通过杀菌烟雾扩散到房间各个角落，封闭门窗，杀菌效果好。二是气体熏蒸剂。利用甲醛溶液挥发进行空气消毒。将2%甲醛溶液（10　mL/m3）加入0.5%高锰酸钾即可挥发浓雾气体，散发至整个房间，封闭门窗1　d后通风，可达到很好的消毒效果[3]。

　　3.2 清洗

　　3.2.1 新玻璃器皿。用1%盐酸溶液浸泡后用洗衣粉水洗涤，再用清水反复冲洗，蒸馏水淋冲，干燥备用。

　　3.2.2 用过的培养瓶。去除瓶内残渣将培养瓶用洗涤液浸泡，然后用清水洗涤3～4次，倒置于架子上至没有流水时转入烘箱中烘烤。

　　3.2.3 污染的培养瓶。首先必须高温灭菌后，再按常规方法清洗。

　　4 接种技术

　　表面灭菌后的植物材料经过切碎或分离出器官或组织，转接到无菌培养基上进行诱导培养及快繁。整个接种过程必须在无菌条件下进行。

　　4.1 准备工作

　　植物材料的选择和预处理、无染菌的培养苗、75%酒精、无菌水、漂白粉、培养皿，无菌纸、超净工作台、灭菌器、剪刀、镊子。

　　4.2 操作要点

　　在无菌环境下将植物材料在消毒的接种盘中剪成每芽一段，注意芽上切口离芽不要太近，一般在0.5　cm左右，芽下切口离芽也在0.5　cm左右。打开已准备好的培养基，在酒精灯无菌圈内接入植物材料，接种时植物材料上切口向上，下切口插入培养基中直立，使芽基部紧贴培养基，接种的容器中植入的数目不宜太多，以3～5个为宜，并保持一定距离，然后将盖子盖上。接种操作要时间短，速度快，技术到位，防止交叉污染[4]。

　　5 组培操作过程引起污染的原因及对策

　　5.1 瓶苗污染与环境污染

　　5.1.1 造成污染的因素。培养基及各种使用器具消毒不彻底；外植体灭菌不彻底，有菌残存在细胞组织中；操作时人为因素带入和交叉污染；环境不清洁；超净工作区域污染等。

　　5.1.2 控制污染的措施。①器具灭菌：接种用的器具除经过高温消毒外，还需在接种过程中避免交叉污染，即用剪刀、镊子对植物茎段进行处理的过程中，每使用1次后，需在酒精灯火焰上灼烧或者插入灭菌器中，轮换使用。②接种过程：在接种过程中，很容易人为带入各种微生物，引起比较严重的污染。应注意以下几点：接种人员要注意个人卫生，特别是手要认真清洗，并用70%酒精进行消毒，还时常用酒精棉球擦手；用70%酒精擦拭需继代转接的培养瓶；在操作区内，不要放入过多的待用培养基，避免气流被挡住；接种者应当熟练操作技术，做到操作娴熟、干练。

　　5.2 接种前后对环境的灭菌

　　接种前打开无菌操作室的紫外灯照射30　min，同时打开超净工作台的紫外灯和风机，在操作时关闭紫外灯并调小风速；接种结束后将植物垃圾带出操作室，并用75%酒精溶液进行拖地，操作结束后打开臭氧发生器定时30　min对整个环境进行灭菌。

　　环境污染也会使各个环节的污染明显增加，严重时会使组培工作无法进行。环境要进行定期的熏蒸消毒，一般用高锰酸钾和福尔马林；在接种室和培养室内，平时还需要紫外灯照射消毒；减少环境污染除加强灭菌外，平时应天天清扫，使环境清洁有序。

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