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返回当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能及时将培养物转到生根培养基上，就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。因此生根培养是使无根苗生根的过程。最后要使生出的不定根浓密而粗壮。生根可采用1/2或者１／４MS培养基，全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素(NAA、IBA等)。
用下列方法诱导生根（1）将新梢基部浸入50或100ppm IBA溶液中处理4～8小时。（2）在含有生长素的培养基中培养4～6天。（3）直接移入含有生长素的生根培养基中。上述三种方法均能诱导新梢生根。但前二种方法对新生根的生长发育更有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。因为当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。但这种方法比较可行。
有时采用下列方法就可生根。（1）延长在增殖培养基中的培养时间。（2）有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量（即将增殖与生根合并为一步）。（3）切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，即没有生根阶段。第三种方法省去了一次培养基制作。切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这往往适于一些容易生根的作物。
少数植物生根比较困难的，需要在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养等，从而诱发生根。
从胚状体发育成的小苗，常常有原先即已分化的根，可以不经诱导生根阶段。但因经胚状体途径发育的苗数特别多，且个体较小，所以也常需要一个低浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段，以便壮苗生根。
试管内生根壮苗的阶段，目的是为了成功地移植到试管外的环境中，使试管苗适应外界的环境因子。不同植物的适宜驯化温度不同。如菊花，以18～20０Ｃ为宜。温度过高牵涉到蒸腾加强。以及菌类易滋生等问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活．春季低温时苗床可加设电热线使基质温度略高于气温2～3０Ｃ，这利于生根和促进根系发达，有利于提前成活。
光强应比以前培养有所提高。以强度较高的漫射光为好，约4000Lx左右为宜，以维持光合作用所需光强。但光线过强刺激蒸腾加强，使水分平衡的矛盾更尖锐。
