蝴蝶兰组培种苗生产技术

　　1 蝴蝶兰组织培养技术

　　1.1 无菌苗获得 蝴蝶兰花梗作为外植体，不仅易获得，而且不会损伤植株，容易诱导。选择侧芽饱满、新鲜、无病毒的蝴蝶兰花梗，整枝取下。在切取花梗时要注意将刀片消毒，以防微生物感染。将取下的花梗，去掉花朵，先用自来水冲洗，再用洗涤精浸泡5～7 分钟，最后用自来水反复冲洗后放在超净工作台上进行表面灭菌。先将花梗剪成3 cm 左右的带芽梗段，用75%酒精浸泡5 分钟，无菌水冲洗3 次，再用2%次氯酸钠消毒20～30 分钟， 最后用无菌水冲洗2～3次，在整个消毒过程中，要不断摇动容器，使其能够均匀全面的消毒。将消毒后的带芽梗段接种在诱导培育基1/2 MS+6-BA 3～5 mg/L+胰蛋白胨0.5～1 g/L+椰乳150～200 ml/L+蔗糖20～25g/L+琼脂5.5～7 g/L。培养20 天后，侧芽萌发长出2 叶片后， 将其切下直接继代增殖或者诱导原球茎。

　　1.2 原球茎诱导 将无菌小苗叶片切成小段，接种在MS+6-BA 4～6 mg/L+NAA 1～2 mg/L+胰蛋白胨0.5～1 g/L+椰乳150～200 ml/L+蔗糖20～25 g/L+琼脂5.5～7 g/L 的培养基上诱导原球茎。培养20 天后，可见叶片弯曲，嫩叶片基本或切口处呈现凹凸不平、逐渐出现愈伤组织状的早期原球茎。继续培养， 可见表面突起一个个圆球，部分表面细胞分化出根毛状物时，将原球茎切割成数小块接到继代培养基中进行继代。

　　1.3 继代增殖 将花梗侧芽诱导的不定芽或者原球茎接种到培养基MS+6-BA 2～5 mg/L+NAA 0.5～1.5 mg/L+胰蛋白胨0.5～1 g/L +椰乳200 ml/L+蔗糖20～25g/L +琼脂5.5～7 g/L 中，一般培养45～60 天转接1 次。通过原球茎途径扩繁蝴蝶兰种苗繁殖系数高， 但是后代苗的变异率较通过不定芽途径获得的后代苗要高。原球茎培养一般2 个月后长出芽，3 个月后长成2～3叶小苗。不定芽培养2 个月后，平均每株长出4片叶、2～3 条根，植株生长健壮，即可转入生根培养。

　　1.4 生根培养 将高达3～4 cm 的小苗接种到生根培养基1/2 MS+NAA 0.5～1 mg/L + 椰乳200 ml/L+蔗糖20～25 g/L +琼脂5.5～7 g/L +活性炭1～2 g/L 中，培养30 天后，待根长出1 cm后可炼苗。

　　1.5 培养条件 蝴蝶兰组织培养温度26±2℃，光照强度1 500～2 000 lx，每天光照10～12小时，培养基pH 调整为5.4～5.7。

　　2 瓶苗锻炼与移栽

　　移栽前，先将无菌苗带瓶移出组培室，放在通风、明亮的常温房间进行炼苗。1～2 个月后，苗长出2～4 根粗壮的根时可以移栽。移栽前3天将瓶盖去掉，每天早、中、晚各喷1 次水，保证足够的湿度。3 天后，用镊子将小苗轻轻夹出培养瓶，洗净根部培养基，用1 500 倍多菌灵药液先浸泡3～5 分钟，再移栽到疏松的苔藓、树皮、椰壳等基质中，环境温度保持在25～28 ℃，空气湿度85%，防止阳光直射，待新叶长出、新根伸长时， 每周叶面喷施1 次0.2%磷酸二氢钾，成苗率可达95%。在此过程中，根据基质的保水情况进行浇水、喷雾，定期进行病虫害预防。

　　3 组培中常见问题及解决办法

　　3.1 微生物污染 细菌、真菌污染是组培生产中最常见的问题， 也是影响蝴蝶兰组培苗生产成本的重要指标之一。细菌污染表现为在培养材料附近出现黏液状物体或浑浊的水迹或出现泡沫的发酵状， 或者在材料附近的培养基中出现浑浊和云雾状痕迹； 真菌污染表现为污染部分长有不同霉菌，颜色有黑、白、黄等。细菌污染一般与接种材料、工具及操作流程有关，真菌污染与环境有关。因此，在组培过程中外植体要尽量选择带菌较少的幼嫩部位， 采取多次灭菌和交替灭菌的方法， 防止外植体带菌； 控制接种室、培养室、培养基及接种器具灭菌条件，确保灭菌质量，操作人员严格遵守无菌操作规程；随时观察种苗的生长状况，及时移除污染培养瓶。

　　3.2 玻璃化 在植物组织培养过程中，叶片和嫩梢呈透明或半透明水浸状的培养物称为玻璃化苗，它是组培苗的一种生理失调症状。玻璃化不仅大大降低组培苗有效增殖系数， 严重影响试管苗质量，还造成人、财、物的极大浪费。蝴蝶兰组培过程中出现玻璃化苗往往是生长调节剂使用过量导致， 可以通过降低培养基中细胞分裂素浓度、增加琼脂浓度、控制培养温度等途径避免，发生玻璃化类原球茎，可在无生长调节剂的培养基中经2～3 代恢复培养， 多数类原球茎会恢复正常。

　　3.3 褐化 褐化是蝴蝶兰组培中最为常见的问题， 主要表现在培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也慢慢变褐而死亡。常用的控制褐化的方法有在培养基中添加抑制褐化剂及控制培养条件等。抑制褐化剂主要分两大类，即活性炭、柠檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等吸附剂和维生素C、谷龙甘肽等抗氧化剂， 生产中应用较多的是活性炭和PVP。也可以采取液体培养，在培养初期黑暗或弱光条件下，保持较低温度（15～20 ℃）来降低褐变。