植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论,近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。植物的组织培养广义又叫离体培养,指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞,原生质体等,通过无菌操作,在无菌条件下接种在含有各种营养物质及植物激素的培养基上进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指组培指用植物各部分组织,如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株,也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养,愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
一 生产环境
1 工作人员进入组培室必须穿工作服,包括更换拖鞋、穿白大褂,接种人员还要带帽、带口罩。
2 所有人员在组培室内不准高声喧哗、打闹。
3 工作期间,各生产房间要关闭房门,尤其是接种间;工作人员出入要随手关门。
4 各种生产用品要安固定的位置排放整齐,不可乱拿乱放。
5 工作过程中所产生的垃圾要及时清理,尤其是接种间,其内垃圾停留时间不得超过4小时。
二 接种程序
1. 准备工作:接种人员在正式接种之前要做好准备工作,包括准备酒精灯、新洁尔灭、灭菌用脱脂棉以及准备接种工具、分取培养基、接种用苗和工作台灭菌等
酒精灯用工业酒精作燃料,而非75%酒精。
工作台上用的新洁尔灭浓度是0.1%,而非0.01%。
工作台灭菌包括两步:一是上台前用紫外灯照射30分钟,二是正式接种前再用新洁尔灭仔细擦一遍。
培养皿的取放:从布包里取培养皿时,一定要注意,手不能接触培养皿的边沿,同时要尽可能减少与培养皿的接触面,一般规定只能用双手的拇指和食指取放。
接种工具灭菌也分两步,一是用灭菌布包裹好,在高压锅里灭一次,这一步由灭菌人员负责完成;二是在工作台上,从布包里取出后,先用酒精擦拭一下,再放在酒精灯火焰上灼烤一遍,其要求是工具的每一点在火焰上灼烤时间不得少于5秒钟。在工具灭菌之前,工作人员的手部,包括手腕,都要用酒精仔细擦拭一遍。
2 接(转)苗:包括取苗、切苗和接苗三步
取苗:先解开培养瓶的瓶盖(封口膜),如果不能一次取出其内的全部材料,要先把封口膜(瓶盖)口对者风源放在酒精灯的左前方,然后把瓶口在酒精灯上烤7~10秒;正式取苗时,瓶口不要斜向外;一次取苗不可太多,以免风干。
切苗:培养皿放在离风窗10~20厘米处,不可太往外;镊子和手术刀都不可太热,好是凉的,且在操作过程中,刀和镊都要培养皿斜上方操作,不可在其正上方操作;在切苗过程中产生的垃圾可堆放在培养皿内的一侧位置上,若非迫不得已,不可弄到培养皿外。
接苗:培养瓶盖(或封口膜)的放置方法和及瓶口灼烤方法与取苗时的相同,烤完瓶口后,要先倒掉瓶内多余的水分,然后在接苗;接苗时,镊子好不要与瓶口接触,一瓶内一般接5~6棵苗,不要放得太多;组培苗在瓶内要排放均匀、整齐、美观。
封口、记录:封口膜要及时捆绑,其松紧度以用手转不动为准;下台前要把品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日期标示到瓶上。离开之前还要把工作台收拾干净,把接种过程中产生的垃圾清理掉,台上的物品也要摆放整齐。
三 组培苗的管理
1.瓶苗要整齐的摆放在自己的组培架上,不可乱放。
2.接种人员每天都要统计自己的接种数量,包括转前瓶数和转后瓶数
3.值日人员要定时开灯、关灯,保证组培苗有足够的光照时间,但也不可过长,以每天14小时左右为宜。
四 接种用具的清洗
1.洗刷培养瓶、培养皿:第一步:把培养瓶培养皿放入洗洁净溶液里,先用毛刷清洗内部,再用钢丝球把外面的字清洗掉。第二步:把他们再用清水冲洗3-5遍。第三步:把瓶内的积水倒掉,倒放在准备台,准备台上要先放一层纱布。这一步的清洁标准是:凉干的瓶壁(器皿)内外无明显的斑点、污迹。
2.洗涮镊子:用洗洁精浸泡五分钟,用钢丝球打磨一下然后放入清水冲洗三遍。
五 灭菌
1.对污染苗灭菌:一经发现就随即灭菌处理,大量的进行高压灭菌,少量的加入工业酒精在室外进行处理。
2.室内空气灭菌:每四周用高锰酸钾和甲醛对室内空气灭一次菌。
3.室内地面:每2-3天用新洁尔灭拖一遍地。
4.卧式和手提式高压灭菌锅使用程序:严格按使用说明书操作。