斑叶兰的组织培养及快速繁殖技术研究

　　斑葉兰（Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.）又名小叶青、银线莲，兰科斑叶兰属（Goodyera），多年生草本植物，高20 cm左右，生于海拔500～2 800 m的山坡或沟谷常绿阔叶林下，喜阴蔽湿润环境[1]。斑叶兰具有较高的药用价值，以全草入药，性寒，味淡;清肺止咳，解毒消肿，活血止痛，软坚散结;在临床用于治疗肺结核、咳嗽、支气管炎、毒蛇咬伤、痈疖疮疡、鼻疖等疾病[2]。另外，斑叶兰叶片十分精美，有宝石兰之称，可小盆栽植放于案上，或做假山、园林的点缀陪衬植物[3]。斑叶兰植物用途广泛，药效显著，药农大肆采掘，使之处于濒危境地。斑叶兰的繁殖一般采用分株法，在自然条件下其繁殖系数极低，一般年繁殖系数在2左右，远远不能满足市场需求。国内外对斑叶兰的组织培养报道较少[4-8]，均处于试验阶段。利用组织培养技术快速繁殖斑叶兰，并运用无土栽培等农业新技术，使野生斑叶兰变家种，有效保护野生资源，解决中药材来源匮乏的问题，满足人们用药需要，对发展中国中医药事业具有重要意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　供试材料斑叶兰为野生驯化种，取自湖北鹤峰木林子自然保护区。

　　以Monnier、1/2MS、White[9]为基本培养基，生长调节剂选用细胞分裂素6-BA（6 -benzylaminopurine）、激动素KT（6-Furfurylamino-purine）、吲哚-3-乙酸IAA（indole-3-acetic acid）、3-吲哚丁酸IBA（3-indolebutyric acid）、萘乙酸NAA（1-naphthlcetic acid），添加物蔗糖、香蕉泥（BJ）、椰子汁（CJ）、活性炭（AC）均为市售，琼脂购自海南省琼海市长青琼脂厂，pH为5.8。

　　1.2 试验方法

　　取当年生5～6 cm斑叶兰幼苗，流水冲洗1 h，剥去上部叶片，洗净，切成1～2 cm长的茎段，用75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞消毒8 min，用无菌水冲洗4～5次，将消毒好的茎段接入配制好的培养基中，培养温度28 ℃，每日光照12 h，光照度2 000 lx，每30 d继代1次[6]。比较基本培养基、附加有机成份、不同植物生长调节剂及其配比对斑叶兰丛生芽的诱导、增殖和植株生根率的影响。其中，基本培养基分别为Monnier、1/2MS和White[9]，在3种基本培养基中均添加1.0 mg/L  6-BA、0.2 mg/L NAA、30.0 g/L蔗糖、6.5 g/L（pH 5.8）琼脂;增殖诱导培养基为1/2 MS培养基，分别附加不同浓度植物生长调节剂、香蕉汁（BJ）、椰汁（CJ）和活性炭（AC）等处理。

　　2 结果与分析

　　2.1 不同基本培养基对斑叶兰芽诱导的影响

　　将相同数量的斑叶兰茎段分别接种在不同的基本培养基上，观察不同时间点的褐化数及出芽数，结果表明，离体幼芽在不同培养基中的生长发育情况存在很大差异，其中1/2MS基本培养基对幼芽的诱导好。由表1可见，在Monnier培养基中培养   15 d，40%幼芽褐化死亡，培养30 d，90%幼芽褐化死亡，10%幼芽萌发1～2个侧芽;在White培养基中培养15 d，50%的幼芽褐化死亡，培养30 d，幼芽全部褐化死亡，出芽率为0;在1/2MS培养基中培养15 d，15%的幼芽褐化死亡，25%的幼芽萌发侧芽，培养30 d时，50%的幼芽萌发侧芽，其余幼芽基本不生长。

　　2.2 不同浓度植物生长调节剂对斑叶兰芽增殖的影响

　　将相同数量的斑叶兰幼芽分别接种在不同浓度植物生长调节剂的1/2 MS+0.5 g/L活性炭基本培养基上，观察其对斑叶兰芽增殖及生长状况的影响。结果表明，在添加不同浓度的6-BA、KT和NAA、IAA的培养基中培养20 d均能生成丛生芽，且随着培养时间的延长丛生芽不断增殖，但增殖率和丛生芽生长状况有显著差异。由表2可见，8个处理中，保持NAA浓度为0.2 mg/L，调整6-BA和KT的浓度，当6-BA浓度为4.0 mg/L时，斑叶兰增殖率高，培养20 d增殖率达370%，30 d即达445%，丛生芽生长较粗壮，颜色呈浓绿色;当KT浓度为4.0 mg/L时，培养30d增殖率达220%，但丛生芽较细弱，颜色黄绿，不如添加6-BA的效果好。而在保持IAA浓度为0.2 mg/L的基础上添加不同浓度的6-BA和KT时，同样是6-BA对斑叶兰丛生芽增殖及生长势影响较好。

　　2.3 培养基中添加香蕉汁和椰汁对斑叶兰丛生芽增殖的影响

　　将相同数量的斑叶兰丛生芽分别接种在添加活性炭（AC）、香蕉汁（BJ）和椰汁（CJ）的1/2MS增殖培养基上[10]，观察其对斑叶兰增殖及生长势的影响。由表3可知，在只添加植物生长调节剂而不加有机添加物的1/2MS培养基上，继代5次后斑叶兰丛生芽逐渐发黄且细弱，甚至部分斑叶兰丛生芽逐渐发黑坏死，并且培养基变红，褐化现象严重;在培养基中添加0.5 g/L活性炭（AC），培养30 d后可以适当改善丛生芽细弱的状况及降低褐化现象，但斑叶兰增殖率有所下降，缘于活性炭有吸附作用，在吸附酚类物质的同时也吸附了部分植物生长调节剂;在培养基中添加100.0 g/L 椰汁（CJ），斑叶兰丛生芽逐渐转绿且增殖率提高，达450%，但培养基仍然变红;而当在培养基中同时添加100.0 g/L椰汁（CJ）和0.5 g/L活性炭（AC）时，苗色恢复正常且逐渐复壮，丛生芽增殖率达470%，培养基不再发红，褐化现象得到解决，添加香蕉汁的效果不如椰汁。

　　2.4 不同培养基对斑叶兰试管苗生根的影响

　　将2 cm左右生长粗壮的斑叶兰丛生芽分切成单株接种到添加不同浓度NAA、IBA、活性炭配比的1/2 MS+椰汁100.0 g/L基本培养基上，培养30 d后，斑叶兰试管苗生根结果见表4。由表4可知，单株苗在生根培养基上培养15 d后开始生根，同时植株也在长高，培养30 d后可长成完整植株。结果表明，单株苗在添加NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L培养基上斑叶兰试管苗生根率高，且每株苗上的生根数量多，根也比较粗壮，易移栽成活。在添加NAA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L培养基上，斑叶兰试管苗生根情况与生长状况无显著差异，而在仅添加IBA 0.5 mg/L的培养基上斑叶兰试管苗生根率只有50%，并且根细弱。

　　2.5 生根苗的移栽技术

　　生根苗的移栽需要选择通气性好、保湿性好的栽培基质，可选细砂∶腐叶土∶珍珠岩=1∶1∶1作为栽培基质。在移栽时，将已生根的组培苗移出培养室置于遮阳网下揭盖炼苗，使其适应外界环境，2 d后将小苗取出，洗净根部琼脂，水苔需进行消毒，小苗移栽后，浇透水，盖膜及遮阳网保湿1周，后3 d每天将膜揭开一半通风1 h，移栽成活率达90%以上[11]。15～30 ℃是斑叶兰生长的适宜温度，夏季高温要加盖遮阳网，35 ℃以上会生长不良，可用湿帘风机进行降温，冬季5 ℃以下的低温会影响植株正常越冬，因此，在冬季温度低于5 ℃的地区栽植斑叶兰必须采取加温和保温措施。

　　3 小结与讨论

　　通过组织培养建立无菌繁殖体系是兰科植物快速繁殖常用的方法，但前人对斑叶兰属植物的组织培养技术研究较少，均处于试验阶段，肖波等[5]的大花斑叶兰种子无菌萌发研究主要利用种子萌发建立无菌性，本研究更测重于对斑叶兰工厂化快速繁殖技术的研究。选取斑叶兰茎段作为外植体进行诱导能保证母株性状，研究了3种不同基本培养基对斑叶兰芽诱导的褐化情况及诱导率，在1/2 MS基本培养基中培养30 d斑叶兰芽诱导率可达50%，褐化率也低。在1/2 MS基本培养基中添加浓度为4.0 mg/L的6-BA与0.2 mg/L的NAA既能取得佳增殖效果，也能使小苗生长健壮，叶色正常。运用KT会导致苗基部产生无效愈伤，从而降低增殖率。

　　在斑叶兰芽增殖继代多次后，对出现的丛生芽细弱问题进行研究，发现继代次数超过5次后丛生芽变细弱，需要在增殖培养基中增加100.0 g/L椰汁以促使幼芽复壮，有利于改善工厂化大量繁殖时苗细弱导致移植室外成活率低的问题。活性炭对于改善斑叶兰离体培养褐化有效果，以 0.5 g/L的浓度为佳。

　　单株苗在添加NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L的1/2MS基本培养基上斑叶兰生根率高，且每株苗上生的根数量多，根也比较粗壮，易移载成活，这与高丽等[8]的高斑叶兰生根试验结果相似。试管苗炼苗移栽是解决斑叶兰从异养到自养过程的关键技术，操作要规范且仔细，出瓶进入基质前必须洗净苗基部的残余培养基，以防烂苗，炼苗过程中要注意保湿、保温和适当光照。

　　利用离体快繁珍稀濒危植物，解决了斑叶兰自然繁殖率低、市场供不应求的局面，降低了用药成本，同时也保护了野生资源，具有良好的经济效益和社会效益。